HPLC 常見(jiàn)問(wèn)題解答，從此實(shí)驗不迷路

A:

①建議檢測前樣品和流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾。

②建議每天做完樣品后及時(shí)進(jìn)行清洗。

③常規檢測：測試完后采用90%有機相沖洗30-45min，最后保存在純甲醇或純乙腈中。

④使用緩沖鹽條件

a.等度條件：使用緩沖鹽之前和之后都用過(guò)渡流動(dòng)相以1ml/min流速沖洗45min

b.梯度條件：使用緩沖鹽之前與初始流動(dòng)相組成相同的過(guò)渡流動(dòng)相以1ml/min流速沖洗45min。

如柱壓升高，可以考慮采用高水相比例再對色譜柱進(jìn)行沖洗30min，最后保存在純有機溶劑中。

A: 

可以分以下這幾種情況去排查：

①確認樣品是否變質(zhì)，如樣品變質(zhì)重新配樣或測試樣品的化學(xué)

②確認溶劑是否變質(zhì)，如溶劑變質(zhì)可以進(jìn)空白溶劑或換其他品牌溶劑;

③檢查柱子中是否有殘留，并對柱子進(jìn)行適當的沖洗;

④檢查儀器管路或檢測池是否被污染，如被污染需沖洗儀器。

A:

可能是以下這幾種原因：

①柱溫變化，控制實(shí)驗室溫度及柱溫箱溫度即可;

②流動(dòng)相混合不均勻，使用HPLC溶劑，高純度的鹽和添加劑， 并確認多元流動(dòng)相互溶性良好。流動(dòng)相在使用前進(jìn)行脫氣;

③流通池被污染或有氣泡，應清洗流通池，流動(dòng)相在使用前脫氣;

④檢測器出口端被堵塞，應取出堵塞物或更換管路;

⑤柱平衡慢，尤其是流動(dòng)相組成發(fā)生較大的改變，先用中等強度的溶劑沖洗柱子即可;

⑥柱子中有強保留物質(zhì)以饅頭峰樣被洗脫，可以改變分析條件，使用保護柱，定期對柱子用強洗脫溶劑(在柱子使用范圍內) 進(jìn)行沖洗。

A: 

①樣品體積過(guò)大：用流動(dòng)相配樣，總的樣品體積小于第一峰的15%。

②在進(jìn)樣閥中造成峰擴展：進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴散。

③數據系統采樣速率太慢：設定速率應是每峰大于10點(diǎn)。

④流動(dòng)相粘度過(guò)高：增加柱溫，采用低粘度流動(dòng)相。

⑤檢測池體積過(guò)大：用小體積池，卸下熱交換器。

⑥保留時(shí)間過(guò)長(cháng)：等度洗脫時(shí)增加強溶劑含量，也可用梯度洗脫。

⑦柱外體積過(guò)大：將連接管徑和連接管長(cháng)度降至最小。

⑧樣品過(guò)載：進(jìn)小濃度小體積樣品。

A:

①泵內有空氣，解決的辦法是清除泵內空氣，對溶劑進(jìn)行脫氣處理。

②比例閥失效，更換比例閥即可。

③泵密封墊損壞，更換密封墊即可。

④溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法。

⑤系統檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可。

⑥梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的。

A: 

①柱溫引起的峰前沿：升高柱溫有助于增加流動(dòng)相傳質(zhì)速率， 從而減少因靜電作用引起的前沿，但溫度過(guò)高會(huì )損傷色譜柱，當含有離子對試劑時(shí)，柱溫小于等于40℃；

②樣品溶劑與流動(dòng)相極性差別大：增加流動(dòng)相極性或樣品用流      動(dòng)相溶解；

③柱效降低：沖洗色譜柱，推薦使用保護柱;

④柱頭塌陷或形成短路：更換手性柱。

A:

如果是正相涂敷型手性柱上的拖尾，先要了解樣品本身的酸堿  性，如堿性手性化合物，在中性流動(dòng)相中會(huì )產(chǎn)生峰拖尾，需要添加堿性添加劑，酸性則需添加酸性添加劑，添加劑的種類(lèi)及  量請見(jiàn)使用說(shuō)明書(shū)，對既有酸性結構又有堿性結構的兩性化合物，必要時(shí)需同時(shí)添加酸性和堿性添加劑(流動(dòng)相需手配以防儀器自動(dòng)混合時(shí)鹽析出)，或可考慮在流動(dòng)相中加入甲醇(比例不大于流動(dòng)相中另一種醇);如果是在鍵合柱正相模式上的拖尾，除以上方法外，還可以加入四氫呋喃、甲基叔丁基醚、二氯甲烷等強洗脫溶劑，或者換用其他流動(dòng)相組成，如甲基叔丁基醚/甲醇、二氯甲烷/甲醇等;如果是反相柱上的拖尾，可換不同的緩沖鹽溶液或有機相。

A:

舊柱“記憶效應”現象。色譜柱在使用過(guò)程中，因樣品、雜 質(zhì)、流動(dòng)相添加劑等會(huì )在柱填料上進(jìn)行吸附，無(wú)法完全除去而保留在柱填料上，形成填料的“記憶效應”。新柱和有記憶效應 的舊柱，手性環(huán)境會(huì )有略微不同，但如果遇到個(gè)別樣品，與舊柱中被修飾的填料作用較好，由于新柱填料無(wú)法完全復制舊柱填料，可能出現舊柱比新柱分離好的情況。應對該問(wèn)題，只能重新優(yōu)化方法。在方法開(kāi)發(fā)之初，也要做好柱子的耐用性考察。