干貨 | 如何精準選擇色譜柱？

液相色譜柱種類(lèi)繁多，在精準選擇液相色譜柱之前，首先必須選擇HPLC的分離模式，根據使用的固定相和流動(dòng)相的組合不同，可以得到下列各種各樣的分離模式。

色譜柱性能影響因素有很多，例如，硅膠純度、色譜柱尺寸、顆粒形狀、粒徑、表面積、孔徑，化學(xué)性質(zhì)包括鍵合類(lèi)型、碳覆蓋率、封端，下面依次介紹各參數對色譜柱性能的影響，并根據以上參數精準地選擇液相色譜柱。

1、硅膠純度

硅膠純度對強極性化合物的分離最為重要，殘留金屬離子濃度、硅膠的雜質(zhì)會(huì )影響化合物的峰形，硅膠表面的金屬含量高會(huì )影響堿性化合物的峰形，易發(fā)生拖尾。

2、色譜柱尺寸

增加色譜柱長(cháng)度，可以在一定程度上提高柱效，但也會(huì )升高壓力和導致峰展寬；含量測定、溶出檢測等對于分離的要求較低，可選用較短的色譜柱，減少運行時(shí)間。內徑大，提高載樣量，但也會(huì )增加橫向擴散，同樣會(huì )導致峰展寬。內徑小的色譜柱靈敏度較高，峰型更窄，但是載樣量較小。如果載樣量滿(mǎn)足要求，需要更高更尖銳的峰提高靈敏度，可以選擇更小內徑，但壓力較大，對系統要求較高。

短柱（15-100mm）運行時(shí)間短、柱壓低；

長(cháng)柱（150-250mm）分辨率高、運行時(shí)間長(cháng)；

小內徑（≤2.1mm）檢測器靈敏度高；

大內徑（3-21.2mm）載樣量高、耐污染、壽命長(cháng)。

3、顆粒形狀

粒徑球形顆粒柱效高、重現性好、柱床結構均勻，不規則形柱床結構不均勻、流動(dòng)相線(xiàn)速度不均勻，容易譜帶展寬；當使用粘度較大流動(dòng)相時(shí)，球形顆?？山档椭鶋?，延長(cháng)色譜柱壽命。

常見(jiàn)的兩種填料顆粒類(lèi)型：

相同鍵合基團鍵合技術(shù)選擇性相同；全多孔填料更為常見(jiàn)，鍵合相種類(lèi)更多；核殼型填料可以在較大的粒徑下得到更高柱效，從而降低使用壓力。

4、粒徑

粒徑指柱填料顆粒直徑的大小，實(shí)際上色譜柱上所標的粒徑是一個(gè)平均值，通常1.5-10μm。粒徑小的色譜柱分離度較好，但色譜柱壓力更大，如果5μm粒徑的色譜柱分離度稍有不足，則同型號3μm色譜柱的分離度一般會(huì )提供令人滿(mǎn)意的選擇性。

5、表面積

表面積是指顆粒外表面與內部孔面積的總和，以m²/g表示，高表面積對于多組分樣品的分離具有較強的保留能力、柱容量和分離度；表面積低的柱填料能迅速達到平衡狀態(tài)，對于梯度洗脫尤為重要。

6、孔徑

孔徑是指填料顆粒的孔或腔的平均尺寸，范圍是120～300?，多孔色譜填料與目標物的作用絕大部分（＞95%）是發(fā)生在填料顆粒的內部，即孔內的，所以孔對于色譜填料也是最重要的參數之一，一款填料孔徑大小(Pore Size)和孔徑分布(Pore Size Distribution)，在絕大多數的色譜分離純化中，起到關(guān)鍵性作用。

大孔徑的填料顆?？梢匝娱L(cháng)大分子溶質(zhì)在填料表面的滯留時(shí)間，達到充分分離，改善峰形，所以大孔徑填料適合分離大分子化合物或者水動(dòng)力體積較大的分子；較小孔徑提供較高的表面積，可用于較大的載荷量，并保留小的有機化合物，可用于小分子有機物到聚合物的分離。

孔徑和粒徑的關(guān)系：

樣品分子直徑小于平均孔徑才能進(jìn)入微粒內部，所選色譜柱孔徑至少是樣品流體學(xué)直徑的4倍，一般根據樣品的分子量選擇適合的孔徑。

分子量＜2000， 選擇孔徑80～180?

分子量＞2000，選擇孔徑300?，300?全多孔色譜柱可用于分離蛋白質(zhì)和多肽。

7、不同的載碳量

載碳量越高，固定相傳質(zhì)效應增加，高載碳量，有利于不易保留化合物的分離，水解穩定性好，重現性好；低載碳量，有利于分析有一定保留的化合物，降低溶劑損耗、減少運行時(shí)間。

8、封端

硅膠鍵合相填料中有部分未封端的殘留硅羥基，封端可以減輕待測組分與硅膠表面殘留的酸性硅羥基反應，改善保留和峰形，這對于堿性化合物尤其重要。而不同的封端技術(shù)也會(huì )直接影響色譜柱的效能。