干貨丨HPLC中干擾峰的來(lái)源

與前兩類(lèi)干擾峰相比，液相系統干擾峰的解決更加困難。液相系統是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，所以此類(lèi)問(wèn)題解決過(guò)程耗費時(shí)間長(cháng)，而且要求實(shí)驗人員有很高的色譜素養。我們對此類(lèi)問(wèn)題來(lái)源主要歸結為三類(lèi)：強保留物質(zhì)、離子對污染和管路滋生細菌。

首先是強保留物質(zhì)的干擾，其主要特征是寬峰。此類(lèi)問(wèn)題多數發(fā)生在等度洗脫中，梯度洗脫主要出現在高比例有機相處。這是由于強保留物質(zhì)在當次進(jìn)樣中未洗脫出，在后續進(jìn)樣洗脫出來(lái)所致。如圖7中9分鐘處的色譜峰。

對于此類(lèi)干擾峰，可通過(guò)延長(cháng)采集時(shí)間或增加洗脫強度來(lái)消除對后續樣品的干擾。至于如何延長(cháng)采集時(shí)間，大家可通過(guò)下面的公式計算得到。

N＝5.54*(tR/Wb/2)^2（1）

由公式（1）推導可知

 tR＝Wb/2 *(N/5.54)^(1/2)（2）

其中，N-塔板數，在等度洗脫中N對所有峰相同；tR-保留時(shí)間；Wb/2-色譜峰半峰寬。

由公式（2）推知，tR2=tR1* W2b/2/W1b/2。積分結果顯示，圖7中，7min處的色譜峰W1b/2=0.12min，9min處的寬峰W1b/2=0.32min，由此可推知，圖7中9min處的寬峰保留時(shí)間tR2=7*0.32/0.12=18.6min。圖8為延長(cháng)采集時(shí)間的圖譜，20min處即為圖7中9min處的色譜峰，與公式推導結果基本接近。延長(cháng)采集時(shí)間后，后續圖譜干擾峰消失。盡管按照此公式計算會(huì )有一定誤差，但這足以讓色譜工作者對其進(jìn)行預判，設置合理的采集時(shí)間。

系統干擾峰第二個(gè)方面是離子對、螯合劑這種難以洗脫的試劑對液相系統的污染。此類(lèi)污染物多半是由于使用完畢含有離子對、螯合劑之類(lèi)的流動(dòng)相后，對系統的沖洗不徹底所致。此類(lèi)污染物主要對一些采集波長(cháng)較低的方法產(chǎn)生干擾，普遍表現是基線(xiàn)噪音大或者干擾峰，但隨著(zhù)方法的運行會(huì )逐漸趨于正常。

系統干擾峰第三個(gè)方面是系統滋生細菌。對于系統滋生細菌，多數大家可能覺(jué)得不可思議，因為液相系統使用完畢都會(huì )用有機相沖洗保存。目前很多方法流動(dòng)相A都是水相，雖然水相每日都會(huì )新配制，但如果由濾頭到比例閥這一段管路長(cháng)時(shí)間在水相中就會(huì )滋生細菌。隨著(zhù)時(shí)間的運行，梯度洗脫中會(huì )逐漸的產(chǎn)生干擾峰。此類(lèi)問(wèn)題雖然比較隱蔽，但比較容易解決，只要每日對放置純水相的通道用有機相沖洗即可避免此類(lèi)問(wèn)題。

以上便是對干擾峰來(lái)源的簡(jiǎn)單分析。然而對于干擾峰的產(chǎn)生，要具體問(wèn)題具體分析，因為其還與具體色譜條件有關(guān)。同一種試劑，在方法A中產(chǎn)生干擾，但在方法B中可能完全沒(méi)有干擾。因為采集波長(cháng)，有機相初始比例及最終比例等因素，都可能會(huì )對干擾峰的出現產(chǎn)生影響。

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實(shí)際工作中，色譜工作者遇到的最大困難是如何識別判斷干擾峰屬于哪一類(lèi)。由于找不清問(wèn)題根源，所以也就難以有針對性的解決問(wèn)題。下面為大家簡(jiǎn)單分享一下解決干擾峰的小經(jīng)驗：

首先，判斷干擾峰是來(lái)自系統還是供試品。此時(shí)需要運行兩次采集：只運行梯度與正常進(jìn)樣。如果只運行梯度，未進(jìn)樣品，依然有干擾峰，這種情況下多半是系統所致，此時(shí)解決方向應針對液相體系，而不是針對供試品。鑒于有些型號的儀器，如果不進(jìn)樣，不會(huì )執行進(jìn)樣的動(dòng)作。因此，對于此類(lèi)儀器，建議執行正常進(jìn)樣與減少進(jìn)樣量?jì)纱尾杉?，根據干擾峰的大小來(lái)判斷是系統原因還是供試品原因。

其次，調查儀器使用記錄，與實(shí)驗人員交流。一般建議查看儀器使用記錄，了解近期運行哪些方法以及這些方法的流動(dòng)相組成。查看完相關(guān)記錄后，再跟實(shí)驗人員交流，了解其操作過(guò)程。比如，對于A(yíng)通道滋生細菌問(wèn)題，我們可以通過(guò)儀器使用記錄發(fā)現，出現干擾峰的儀器近一周都是在運行同一個(gè)方法。實(shí)驗記錄顯示，此方法的流動(dòng)相為0.1%的磷酸水溶液，因此可能是系統滋生細菌所致。但實(shí)驗人員告知，每天晚上都會(huì )用有機相沖洗色譜柱，不可能滋生細菌。再次詢(xún)問(wèn)得知，實(shí)驗人員每晚的沖洗是切換成C通道執行，而A通道卻一直在0.1%的磷酸水溶液中。因此，切換通道沖洗系統這種不規范操應盡量避免。

第三，采取單因素試驗解決問(wèn)題。每次只改變一個(gè)因素，逐步找到干擾峰的來(lái)源。此類(lèi)做法看似比較費時(shí)費力，但卻讓色譜工作者對各類(lèi)色譜問(wèn)題產(chǎn)生原因有理性認知，增強了色譜工作者解決問(wèn)題能力，有助于后期問(wèn)題的解決排查。

最后，對單因素排查出的解決方案進(jìn)行驗證，將問(wèn)題重現。如果根據單因素變量找到的解決方案無(wú)法將問(wèn)題重現，很有可能排查出的影響因素并不是問(wèn)題真正的根源，需繼續排查。能夠重現問(wèn)題，問(wèn)題才算解決，方可將其關(guān)閉，不再研究。