在液相的使用中，開(kāi)發(fā)方法或方法驗證時(shí)最重要的一步就是流動(dòng)相的選擇和比例的調整。我想大家肯定都遇到過(guò)分離度不好或峰形不好的情況，其中一種原因就是流動(dòng)相沒(méi)調好。那究竟該怎么調，怎么選擇呢？看完下文可能你就知道答案了。
圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò )，侵刪
一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然后根據出峰情況調整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調整的過(guò)程中，注意觀(guān)察各個(gè)峰的分離情況。當分離達到一定程度，應將有機溶劑10%的改變量調整為5%，并據此規則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。
1、流動(dòng)相的性質(zhì)要求一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品等特征。選擇流動(dòng)相時(shí)應考慮以下幾個(gè)方面：①流動(dòng)相應不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹(shù)脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機相會(huì )溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統。②純度：色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過(guò)有關(guān)，特別是當溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測波長(cháng)下應沒(méi)有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時(shí)，應選擇折光系數與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相，以提高靈敏度。④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會(huì )影響溶質(zhì)的擴散、傳質(zhì)，降低柱效，還會(huì )使柱壓降增加，使分離時(shí)間延長(cháng)。最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相。⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會(huì )在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會(huì )使柱子惡化。2．流動(dòng)相的pH值采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時(shí)，通過(guò)調節流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱(chēng)為反相離子抑制技術(shù)。對于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。注：流動(dòng)相中加入有機胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱(chēng)為減尾劑或除尾劑。三乙胺（triethylamine）氨分子中的氫原子被3個(gè)乙基取代的產(chǎn)物。分子式(CH?CH?)3N。易揮發(fā)的無(wú)色液體，有氨的氣味。熔點(diǎn)－114.7℃，沸點(diǎn)89.3℃，相對密度0.7275（20／4℃）。溶于水和乙醇、乙醚等有機溶劑。三乙胺有堿性，與無(wú)機酸能生成易溶于水的鹽類(lèi)?？捎蒒，N- 二乙基乙酰氨與氫化鋁鋰反應制取，也可用乙醇胺進(jìn)行氣相烷基化反應合成。用于制橡膠硫化促進(jìn)劑、潤濕劑和殺菌劑等，也可用作溶劑和用于合成四級銨化合物。3. 如何選擇緩沖液pH值在選擇緩沖液pH值之前，應先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka兩個(gè)pH值單位的，有助于獲得好的、尖銳的峰，從公式：pH = pKa + log([A-]/[HA])得知，溶液PH值高于或低于Pka兩個(gè)單位，化合物中99％以一種形式存在，而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。顯示的是它的離子形式和中性化合物的轉變，苯甲酸的Pka等于4.2，理論上由公示得知，當溶液pH值等于2.2時(shí)，99％的苯甲酸以中性化合物存在，pH值等于6.2時(shí)99%的苯甲酸以離子形式存在，所以當緩沖液pH值等于2.2時(shí)，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱。
圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò )，侵刪
4．流動(dòng)相的脫氣HPLC所用流動(dòng)相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會(huì )影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線(xiàn)穩定性，甚至使無(wú)法檢測。（噪聲增大，基線(xiàn)不穩，突然跳動(dòng)）。此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會(huì )引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來(lái)誤差。溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò )合物，此絡(luò )合物會(huì )提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會(huì )在梯度淋洗時(shí)造成基線(xiàn)漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會(huì )引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學(xué)檢測中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更大。除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500mL溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液面不要高出水面太多。離線(xiàn)（系統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開(kāi)始回到溶劑中。在1~4小時(shí)內，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。在線(xiàn)（系統內）脫氣法無(wú)此缺點(diǎn)。最常用的在線(xiàn)脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí)，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來(lái)說(shuō)，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來(lái)。此外還有在線(xiàn)脫氣機。一般說(shuō)來(lái)有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法，這種連續脫氣法在電化學(xué)檢測時(shí)經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。
圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò )，侵刪
5．流動(dòng)相的過(guò)濾所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45μm（或0.22μm）濾過(guò)，以除去雜質(zhì)微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明“已濾過(guò)”）。用濾膜過(guò)濾時(shí)，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機相濾膜一般用于過(guò)濾有機溶劑，過(guò)濾水溶液時(shí)流速低或濾不動(dòng)。水相濾膜只能用于過(guò)濾水溶液，嚴禁用于有機溶劑，否則濾膜會(huì )被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對于混合流動(dòng)相，可在混合前分別濾過(guò)，如需混合后濾過(guò)，首選有機相濾膜?，F在已有混合型濾膜出售。6．流動(dòng)相的貯存流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長(cháng)霉，應盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，并在3天內使用，用前應重新濾過(guò)。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長(cháng)的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無(wú)此現象。7．鹵代有機溶劑應特別注意的問(wèn)題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統中的不銹鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl?、CHCl?等）與各種醚類(lèi)（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合后，可能會(huì )反應生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物，這種混合流動(dòng)相應盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH?Cl?）與一些反應性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時(shí)，還會(huì )產(chǎn)生結晶?？傊?，鹵代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會(huì )產(chǎn)生類(lèi)似問(wèn)題。1.流動(dòng)相溶劑應選擇HPLC的溶劑或依此為標準的溶劑。流動(dòng)相使用前用0.45μm濾膜過(guò)濾、脫氣，清除微粒和灰塵。在送液泵內，為了防止雜物（固體）進(jìn)入流路，裝有吸濾器，但網(wǎng)孔徑為10μm，比此更小的顆粒仍然可通過(guò)，這會(huì )導致流路和柱子堵塞和污染。為此，建議常用0.45μm濾膜過(guò)濾。流動(dòng)相溶劑須經(jīng)脫氣，如不脫氣，在溶劑混合時(shí)，或壓力溫度變化時(shí)容易產(chǎn)生大量氣泡，會(huì )導致泵誤動(dòng)作和輸液不暢，檢測器產(chǎn)生噪聲信號等。
2.流動(dòng)相恢復到室溫后使用。流動(dòng)相溫度與室溫相差時(shí)，流動(dòng)相在恢復到室溫前，基線(xiàn)水平很難穩定，特別是發(fā)生漂移，也容易產(chǎn)生氣泡等現象。水與有機溶劑混合時(shí)，混合液變化大，往往會(huì )與室溫相差很大，務(wù)必注意。3.做HPLC流動(dòng)相的試劑應用HPLC級的、水應用二次蒸餾水，水相流動(dòng)相需經(jīng)常更換，防止長(cháng)菌變質(zhì)。使用去離子水、針劑水、純凈水（炊用）并不合適、尤其是做梯度洗脫時(shí)，水中的不純物會(huì )成為鬼峰，從而干擾分析結果。4.流動(dòng)相的pH值過(guò)高或過(guò)低，流動(dòng)相使用純水，使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液，使用離子對試劑等，均可能造成色譜柱填料被化學(xué)破壞，這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復的。5.用緩沖鹽做流動(dòng)相時(shí)，在使用前和使用后都要用水清洗流路，禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過(guò)夜或更長(cháng)時(shí)間。6.若需要使用含鹽的流動(dòng)相，使用前請務(wù)必過(guò)濾。并且使用該含鹽流動(dòng)相前，色譜柱需先用低比例有機相（有機相含量應不低于10%）的溶液沖洗，以免緩沖鹽析出。流動(dòng)相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液，建議現用現配，以免流動(dòng)相因滋生微生物而造成柱填料的污染。7.進(jìn)行梯度實(shí)驗時(shí)要注意梯度變化過(guò)程中流動(dòng)相的互溶性，避免因流動(dòng)相不互溶而導致的緩沖鹽析出問(wèn)題。反相系統更換正相系統或正相系統更換反相系統時(shí)，用異丙醇置換系統內的儲存流動(dòng)相后在接柱子。8.在更換兩種互不相溶的流動(dòng)相時(shí)，中間要用異丙醇溶液清洗過(guò)渡。例如：先用甲醇水做流動(dòng)相，然后在用正己烷做流動(dòng)相時(shí)，一定要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水，然后用正己烷沖洗異丙醇，反之也是一樣。在更換流動(dòng)相時(shí)還要考慮色譜柱是否更換。9.儀器在短期（兩三天）不用時(shí)，流路中可以是甲醇或水。儀器在長(cháng)期不用時(shí)，流路中應用甲醇。10.對于UV等檢測器用于高靈敏度檢測時(shí)，要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動(dòng)相溶劑，如甲醇、乙腈等。11.當流動(dòng)相溶劑為乙腈時(shí)，流速為1ml/min泵的正常壓力5～7Mpa之間，如果壓力逐漸降低，基線(xiàn)也出現異常。這是由于乙氰的粘性大，導致泵的流速降低?？蛇m當提高流速使泵的壓力恢復正常即可。12.流動(dòng)相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶劑，會(huì )對流路中的PEEK樹(shù)脂管路強度變成差、PEEK樹(shù)脂管容易破裂使溶劑外濺。流動(dòng)相含有鹵素離子的溶劑，如KCI、NaCI、NH?CI等。對流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用，以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時(shí)，分析完了后，應立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈。13.用于檢定梯度等性能時(shí)，短時(shí)間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒(méi)有問(wèn)題的。注意：稀硝酸與甲醇不能混合，否則有可能會(huì )引起爆炸。
圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò )，侵刪
流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液由于容易長(cháng)霉，應盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，并在3天內使用，用前應重新濾過(guò)。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長(cháng)的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無(wú)此現象。
地址：廣州市黃埔區攬月路3號國際企業(yè)孵化器F座310
電話(huà)：18922204815 
傳真：020-84418344
郵箱：mzzhang@chiral-se.com
