溶劑效應——如何消除色譜峰這個(gè)隱形“殺手”？附破案妙招
峰型問(wèn)題是液相色譜分析中最常遇見(jiàn)的問(wèn)題之一，造成峰型異常的原因非常多，今天我們一起來(lái)探討一下因稀釋劑與流動(dòng)相的強度差異所造成的峰型異常的典型“殺手”，也就是我們常說(shuō)的“溶劑效應”。
溶劑效應指稀釋劑溶劑強度大于流動(dòng)相時(shí)造成色譜峰變形的現象。如用THF溶解樣品，注入流動(dòng)相為乙腈-水（18:82）的反相系統中，可能會(huì )造成峰分叉或拖尾的結果，還會(huì )導致保留時(shí)間漂移。
表現為液相色譜上較早洗脫的峰前沿或分叉（也有可能表現為肩峰），較晚洗脫的峰則較為正常。也可能全部峰均出現分叉的情況，視溶劑強度而定。
在分析某手性樣品時(shí)因溶劑效應產(chǎn)生的兩個(gè)分叉峰
第一階段：樣品剛被注入系統，進(jìn)入色譜柱后，流動(dòng)相氛圍中的目標物以正常速度被洗脫。因強溶劑洗脫，移動(dòng)速度快，樣品在空間上開(kāi)始慢慢分裂。
第二階段：在一定時(shí)間內，溶劑氛圍中的目標物移動(dòng)始終快一些，前后兩部分距離擴大。但移動(dòng)快的目標物所處氛圍逐漸被流動(dòng)相稀釋(注：因為溶劑和流動(dòng)相均不保留)，其移動(dòng)速度會(huì )逐漸降至正常流速。直到前面目標物的氛圍完全被流動(dòng)相替代，前后兩部分的距離穩定下來(lái)。因而，樣品溶劑與流動(dòng)相洗脫強度差距越大，兩部分目標物最終的距離拉的越大。
第三階段：所有目標物在色譜柱中正常移動(dòng)，但分裂已不可逆轉。
經(jīng)過(guò)檢測器，同一目標物給出了兩個(gè)色譜峰。其中進(jìn)柱前即擴散進(jìn)入流動(dòng)相的那部分目標物組成了后面的色譜峰，它的保留時(shí)間與目標物的真實(shí)保留時(shí)間基本吻合。
簡(jiǎn)單概括，強洗脫溶劑不均衡地參與了目標物的洗脫，使色譜峰保留時(shí)間整體提前，而樣品在柱前的不充分擴散導致了峰形扭曲。這種影響輕則導致峰展寬，嚴重時(shí)甚至導致峰裂分，給定性定量帶來(lái)災難。
反相色譜系統中溶劑強度的順序為：
水（最弱）＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氫呋喃＜丙醇＜二氯甲烷（最強）
正相色譜系統溶劑強度順序為：
正己烷（最弱）＜醇/正己烷混合＜乙醇＜四氫呋喃
溶解樣品的溶劑強度大于該樣品出峰時(shí)流動(dòng)相強度，樣品溶劑可以看成流動(dòng)相的一部分，一部分樣品溶解于溶劑中會(huì )被迅速洗脫出色譜柱，而一部分樣品溶解于流動(dòng)相，被流動(dòng)相洗脫出，這樣會(huì )造成色譜峰的展寬或者分叉。
當進(jìn)樣體積較小時(shí)，擴散至流動(dòng)相中的溶質(zhì)占大多數，且擴散在很短時(shí)間內完成，因此峰形與用流動(dòng)相直接溶解樣品無(wú)大差異。隨著(zhù)進(jìn)樣的體積增大，留在溶劑本身里的溶質(zhì)的量逐漸增大，當進(jìn)樣體積增大到一定數量，留在溶劑里的溶質(zhì)的量變得不可忽略，在色譜圖上就表現為色譜峰的分叉、拖尾等。
有時(shí)，當我們使用流動(dòng)相或流動(dòng)相中的有機相無(wú)法直接溶解樣品，這時(shí)很多小伙伴會(huì )選擇使用氯仿、甲苯等能溶的溶劑，甚至DMSO這樣的“萬(wàn)能溶劑”來(lái)溶解樣品。這樣進(jìn)樣的結果是溶劑與流動(dòng)相不兼容，溶質(zhì)難以在流動(dòng)相中擴散。
又如，在做參比制劑的溶出曲線(xiàn)中，溶媒中經(jīng)常加入表面活性劑。而帶有表面活性劑的溶劑進(jìn)樣后，由于溶質(zhì)在含有表面活性劑的溶劑中的分配系數與在流動(dòng)相中的分配系數存在較大差異，就會(huì )導致峰形的問(wèn)題，甚至保留時(shí)間的漂移。
電離狀態(tài)的差異主要由溶劑和流動(dòng)相各自的pH差異引起。我們都知道，在反相體系中，目標化合物的存在狀態(tài)不同，保留行為會(huì )有明顯的差異，而存在狀態(tài)就取決于目標化合物在不同pH體系內的電離狀態(tài)。若樣品在溶劑和流動(dòng)相中電離狀態(tài)差異較大，樣品溶液在接觸流動(dòng)相的過(guò)程中，來(lái)不及緩沖至流動(dòng)相中的電離狀態(tài)，這個(gè)時(shí)間如果較長(cháng)，就容易表現為保留時(shí)間發(fā)生錯位或峰形變形，如下圖的案例。
流動(dòng)相為pH 3.0緩沖鹽。綠色譜圖為對照品，另外三個(gè)譜圖樣品的溶劑從下至上分別為0.1%磷酸、純化水、pH 3.0流動(dòng)相
柱前管路內徑越大、管路越長(cháng)，越利于目標物向流動(dòng)相擴散，而且使用更粗的管路比更長(cháng)的管路有效(注：假設死體積相同)。雖然粗的管路加劇了等度條件下的柱外展寬，對柱效有危害，然而相較于峰分叉的危害而言，前者尚能接受。
這就是為什么有時(shí)候會(huì )發(fā)現，HPLC的液相（管路死體積大）比UPLC的液相（管路死體積?。┥V峰型好。
1.導致柱效下降，影響分離。
2.影響峰形，甚至影響定量、定性結果。比如，在LCMS中，掃描前體離子時(shí)，遇到這種情況，甚至不知道哪個(gè)峰才是目標物。
3.當標樣和樣品的溶劑不一致時(shí)，保留時(shí)間不吻合，同樣影響定性。如酒類(lèi)成分分析，標樣溶于純水，樣品是過(guò)濾的酒，后者的溶劑就是乙醇水，它的保留時(shí)間必定早于純水溶解的標樣；再比如水中污染物分析，目標物溶于有機相得到標樣，而樣品是過(guò)濾后的天然水；
4.強洗脫的溶劑在基質(zhì)中提取出的雜質(zhì)遇流動(dòng)相會(huì )析出，堵塞針座、柱前管路或色譜柱。
調整稀釋劑或流動(dòng)相，使二者洗脫能力接近，或稀釋劑洗脫能力稍低于流動(dòng)相。
一般情況下，為避免溶劑強度差異導致的溶劑效應，反相色譜中較為穩妥的做法是稀釋劑中有機相比例和流動(dòng)相相當，必要時(shí)可略高于流動(dòng)相，但應當據其評估其溶劑效應風(fēng)險。
如下圖，我們在分析手性化合物時(shí)發(fā)現所有主峰均出現肩峰（或分叉峰），這種情況很容易考慮沒(méi)拆開(kāi)。但所有主峰都分叉的現象在手性化合物分析中是非常罕見(jiàn)的，考慮溶劑效應后，用流動(dòng)相溶解樣品后，肩峰消失。
為保證峰形，進(jìn)樣體積一般控制在5-20μL，盡量不超過(guò)25μL。
如不能減少至合適的進(jìn)樣體積，應盡量選擇與流動(dòng)相比例相同或接近的溶劑。
使溶劑與流動(dòng)相有較好兼容，目前辦法有兩個(gè)：
a. 若流動(dòng)相或流動(dòng)相中的有機相無(wú)法直接溶解樣品，則用可以溶解樣品的溶劑溶解成高濃度儲備液，然后用流動(dòng)相稀釋至所需濃度。
b. 在流動(dòng)相中加入同樣的助溶劑或表面活性劑，或提高有機相的比例。
電離狀態(tài)的差異許多情況下會(huì )表現為保留時(shí)間的漂移或不穩定?？梢酝ㄟ^(guò)將樣品溶液的pH調節至與流動(dòng)相一致，或增大流動(dòng)相的緩沖能力來(lái)改善。
若采用梯度洗脫，在不影響分離度的情況下，可以改用較粗內徑的柱前管路。但此法不適用于等度洗脫，會(huì )降低柱效。
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