在化學(xué)的廣闊領(lǐng)域中，手性分子以其獨特的性質(zhì)和廣泛的應用吸引了眾多科學(xué)家的關(guān)注。從藥物研發(fā)到材料科學(xué)，手性方法的開(kāi)發(fā)不僅是科學(xué)研究的前沿，也是技術(shù)創(chuàng )新的重要方向。今天，小研就來(lái)跟大家聊聊手性方法開(kāi)發(fā)的一些小知識，走進(jìn)這個(gè)充滿(mǎn)奧秘的世界。手性分子，是化學(xué)中結構上鏡像對稱(chēng)而又不能完全重合的分子。碳原子在形成有機分子的時(shí)候，4個(gè)原子或基團可以通過(guò)4根共價(jià)鍵形成三維的空間結構。由于相連的原子或基團不同，它會(huì )形成兩種空間構型不同的分子結構，兩者的物理化學(xué)性質(zhì)相同，但是在生理藥理性質(zhì)上卻可能有很大差異，在藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)、毒理學(xué)等方面往往存在差別，有的甚至作用完全相反。從分子的空間結構來(lái)看，它們是兩種分子。由于是三維結構，它們像是左手和右手、鏡子里和鏡子外的物體那樣，看上去互為對映，但不管怎樣旋轉都不會(huì )重合。因此這兩種分子具有手性，是手性分子，它們互為同分異構體，這種手性異構形式分為R型和S型。
用于判斷空間結構是否具有對稱(chēng)性的參數有：對稱(chēng)中心、對稱(chēng)軸、對稱(chēng)面和交替對稱(chēng)軸。其中對稱(chēng)軸的有無(wú)，對分子是否具有手性沒(méi)有關(guān)鍵性影響，而具有對稱(chēng)中心、對稱(chēng)面和交替對稱(chēng)軸的化合物若可以與其鏡像重合，則為非手性分子；反之，則為手性分子。
還有一個(gè)判斷分子是否具有手性的簡(jiǎn)單方法，那就是判斷手性碳原子是否存在：一個(gè)碳原子上連著(zhù)四個(gè)互不相同的基團，空間上有兩種不同的排列結構，這種碳原子稱(chēng)為手性碳原子。一般來(lái)說(shuō)，手性化合物一定具有手性碳原子（也有手性氮原子和硫原子的存在），但如果一個(gè)化合物具有兩個(gè)手性中心，那么此化合物可能為內消旋體，沒(méi)有手性現象。
手性分析開(kāi)發(fā)方法的類(lèi)型手性色譜柱是通過(guò)手性固定相與化合物之間作用力的差別來(lái)實(shí)現對映異構體的分離，隨著(zhù)手性固定相有了越來(lái)越多的種類(lèi)，目前大部分手性化合物都是用手性色譜柱進(jìn)行分離。
手性化合物與手性衍生試劑反應，使得一種構型與其對映異構體產(chǎn)生物理性質(zhì)的差異，從而可以在反相色譜上根據分配比的不同實(shí)現手性異構體的分離。此種方法隨著(zhù)手性固定相的開(kāi)發(fā)，占據的優(yōu)勢越來(lái)越小。將手性試劑加入到流動(dòng)相中，在洗脫過(guò)程中，手性試劑與對映異構體結合，形成非對映異構體，從而實(shí)現在固定相中保留時(shí)間的差異，達到分離的目的。根據固定相的不同，目前市場(chǎng)上所售的手性色譜柱有以下類(lèi)型：1）多糖衍生物類(lèi)色譜柱：此類(lèi)固定相為纖維素衍生物和直鏈淀粉衍生物，適用于含有酰胺基、芳香環(huán)取代基、羰基、硝基、磺?；?、氰基、羥基、氨基等化合物的手性分離。2）環(huán)糊精類(lèi)色譜柱：異構體分子可嵌入環(huán)糊精疏水性空洞內形成包絡(luò )復合物，衍生后特別適合芳香型化合物的手性分離。3）蛋白質(zhì)類(lèi)手性色譜柱：固定相為特定酶類(lèi)蛋白質(zhì)，主要分離具有苯環(huán)結構的伯胺和仲胺的化合物，用于反相色譜。4）冠醚類(lèi)手性色譜柱：固定相為冠醚類(lèi)手性固定相，主要分離氨基酸及手性中心有氨基的化合物。5）其他色譜柱：離子交換色譜柱，配體交換色譜柱，多用于氨基酸及其衍生物對映異構體的分離。上述的色譜柱的應用范圍最廣的當屬多糖衍生物類(lèi)的色譜柱，可以分離目前市面上80%以上的已知手性藥物。
對于藥物研發(fā)中小分子化合物的手性分離，最多采用的色譜柱為多糖衍生物類(lèi)色譜柱，此類(lèi)手性色譜柱應用廣泛，可分離的化合物種類(lèi)多，因此就針對此類(lèi)手性色譜柱方法開(kāi)發(fā)的幾個(gè)重要因素進(jìn)行表述：多糖衍生物類(lèi)手性色譜柱的固定相主要分為：纖維素衍生物和直鏈淀粉衍生物。兩者的空間結構均是螺旋型腔體，該腔體對化合物分子有包含作用力。而直鏈淀粉的空間結構比纖維素的空間結構要更大、更規律，作用力稍強一些。此外，多糖衍生物類(lèi)色譜柱又分為鍵合型和涂敷型兩種，鍵合型色譜柱對于流動(dòng)相體系的可選范圍更大，能夠耐受各種強溶劑，且不易發(fā)生柱流失。流動(dòng)相體系的選用是與固定相之間形成一個(gè)競爭機制，在流動(dòng)相的洗脫下將對映異構體進(jìn)行分離。選定色譜柱后，可選用的溶劑種類(lèi)也有了一個(gè)范圍，在色譜柱溶劑使用的范圍內進(jìn)行流動(dòng)相體系的依次篩選。在篩選的初步，首先使用常規流動(dòng)相，例如正己烷，正庚烷，異丙醇，乙醇等的流動(dòng)相，再選用非常規的流動(dòng)相體系，如二氯甲烷，乙酸乙酯等。選定了流動(dòng)相以后，再進(jìn)行流動(dòng)相比例的調節。由于基線(xiàn)漂移問(wèn)題，在正相體系中一般多采用等度洗脫模式，而較少采用梯度洗脫，梯度洗脫基線(xiàn)變化非常大，容易出現不明峰。1）流速的調節：通常色譜柱會(huì )提供一個(gè)建議流速，例如1mL/min，但有時(shí)在此條件下分離度不夠，那么可以降低流速使得分離度合格。2）柱溫的調節：通常條件下，低溫有利于分離，因為低溫下傳質(zhì)阻力減弱，流動(dòng)相的粘度增大，更有利于異構體分離，但是也有例外情況，有的化合物對溫度敏感，柱溫會(huì )影響化合物的分離。3）波長(cháng)的選定：手性方法開(kāi)發(fā)中，波長(cháng)的選用相對較為簡(jiǎn)單，選擇的標準是吸光度相同，且該波長(cháng)下吸光度穩定，則方法的耐用性良好。一般會(huì )選擇化合物的最大吸收波長(cháng)，但若方法中使用了添加劑，那么波長(cháng)的選用應大于添加劑的截止波長(cháng)，避免基線(xiàn)影響檢測。4）濃度選定：根據選定波長(cháng)下異構體的峰高和峰寬情況，確定檢測的靈敏度，進(jìn)而確定測定濃度。色譜參數的調節需要我們研發(fā)工作者針對不同化合物進(jìn)行獨立探討和實(shí)驗，最后確定最終的參數。對于剛開(kāi)始入門(mén)的所有的分析人員來(lái)說(shuō)，可能希望找到一種模式，使得對所有的化合物都有效，比如，低溫一定有助于分離，異丙醇一定比乙醇的體系分離度好等等。但實(shí)踐出真知，科學(xué)實(shí)驗應該具體問(wèn)題具體分析。
添加劑可以分為酸性添加劑和堿性添加劑。加入添加劑的目的有兩個(gè)：第一，有效改善峰形，色譜硅膠填料的性質(zhì)決定了加入堿性添加劑，可以起到掃尾的作用；第二，調節pH可以改善樣品在溶劑中官能團的解離。
那么如何選擇酸堿添加劑？
1）堿性化合物首選堿性添加劑，例如三乙胺 、二乙胺等，添加堿性添加劑可以有效地防止化合物和硅羥基之間的相互作用而引起的拖尾現象。
2）酸性化合物首選酸性添加劑：例如三氟乙酸，醋酸等，多糖衍生物類(lèi)手性固定相的極性較大，酸性化合物可能與固定相的結合過(guò)牢，從而導致色譜峰洗脫不出來(lái)，或者峰形嚴重拖尾，加入酸性添加劑可以有效抑制化合物的解離，實(shí)現化合物的分離。
色譜柱都有pH的耐受上限，每一款不同的色譜柱的說(shuō)明書(shū)上都標有最高酸堿添加量，若是超過(guò)上限則會(huì )對色譜柱的壽命有很大影響。
多糖衍生物可以在水中和鹵代烷烴中溶解，手性方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中應避免使用這一類(lèi)溶劑（特殊處理工藝的色譜柱除外），所以常規條件的流動(dòng)相多選用烷烴和醇類(lèi)。在正相色譜中，固定相極性較大，那么醇類(lèi)為強洗脫性溶劑，烷烴類(lèi)為弱洗脫性溶劑。進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)時(shí)，首選正己烷和乙醇，這一組體系不能將化合物進(jìn)行分離，將乙醇更改為異丙醇或者正丙醇，或者將正己烷改為正庚烷，可能會(huì )有很大的改善，也可能效果不明顯，每一種化合物和溶劑之間的相互作用需要不斷的嘗試。在整體的研發(fā)中，可能會(huì )遇到相互矛盾的情況出現。例如：異構體的分離度不夠，流動(dòng)相中增高烷烴的比例，分離度合格了，但該比例下靈敏度的信噪比太小，靈敏度和分離度之間形成了矛盾，此時(shí)應嘗試改變柱溫或變更流動(dòng)相體系來(lái)滿(mǎn)足分離的要求。
結語(yǔ)
在實(shí)驗室不能提供很多的色譜柱及項目時(shí)間緊張的情況下，可以將樣品送到國內專(zhuān)門(mén)生產(chǎn)手性色譜柱的廠(chǎng)家——廣州研創(chuàng )，進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)摸索可以省時(shí)省力，也不失為一個(gè)便捷的方法。手性方法開(kāi)發(fā)中的小知識就先分享這些，歡迎大家一起來(lái)探討學(xué)習。咨詢(xún)、訂購歡迎聯(lián)系：18922204815/020-32051815。
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