C18色譜柱會(huì )受到填料類(lèi)型和柱規格的影響嗎？

高效液相色譜（HPLC）具有高選擇性、高靈敏度和快速分析的特點(diǎn)，大部分可溶解的藥物都可通過(guò)該方法進(jìn)行分析，因此已成為藥物分析的首選技術(shù)。碳十八硅烷化學(xué)鍵合硅固定相（C18或ODS）的反相色譜在液相色譜分析中表現出色，相較于其他色譜具有明顯優(yōu)勢。C18反相色譜能夠直接分析水溶性樣品，適用范圍廣泛，被譽(yù)為“標準固定相分離模式”。在各國藥典中涉及使用液相色譜檢測的品種中，C18色譜柱是最常被廣泛應用的固定相。

由于鍵合方式、粒徑、長(cháng)度和內徑等多個(gè)因素不同，C18色譜柱展現出不同的選擇性。市場(chǎng)上出現了數百種具有不同分離特性的C18柱。如何在繁多的C18柱中找到適合自己分析的那種，是一個(gè)值得深入探討的課題。

C18柱的選擇主要考慮兩個(gè)因素，分別是填料材料和規格對色譜柱的影響。

1、C18填料對色譜柱的影響

填充物的物理特性對填充物色譜行為有重要影響。主要的物理特性包括：粒徑、孔徑、孔容量、固定相化學(xué)性質(zhì)、碳含量以及烷基化處理。

(1) 顆粒度是指填料顆粒的直徑大小。色譜柱上注明的顆粒徑實(shí)際上是一個(gè)平均值。例如，“5μm”的顆粒徑并不代表柱內所有填料顆粒的直徑都是5μm，實(shí)際上存在顆粒分布。這種分布對柱的反壓和效果有重要影響。通常來(lái)說(shuō)，顆粒越細，顆粒分布越小，色譜柱效果越好，反壓也越高。目前C18柱的填料顆粒徑為4至10μm。

(2) 孔徑是指填料顆粒之間的空隙尺寸。通常所說(shuō)的孔徑是指填料的平均孔徑大小。球形填料填充柱后，平均孔徑分布較為集中，柱床結構均勻，分離效果好，穩定性高；而非球形填料的平均孔徑分布較為廣泛，柱床結構不均勻，流體相速度不均勻，色譜吸附帶有擴散。平均孔徑的大小對于分離大分子化合物有很大影響，在分離含有大分子化合物的樣品時(shí)可能會(huì )出現分子排阻效應，或引起吸附效應，從而影響回收率和準確度。因此，在用反向相色譜分離如蛋白質(zhì)或多肽樣品時(shí)，應考慮使用大孔徑(如30納米)的反向相柱填料?？左w積作為硅膠多孔性的參數，在分離較大分子化合物時(shí)可作為參考，選擇具有較大孔體積的反向相柱填料。

(3) 化學(xué)鍵合填料在高效液相色譜中扮演著(zhù)非常關(guān)鍵的角色。它可以連接高極性的有機基團，并且使用低極性溶劑作為流動(dòng)相。同樣，它也可以連接低極性的有機基團，并且選用高極性溶劑作為流動(dòng)相。C18 色譜柱采用了硅烷烷化鍵合方式（Si-O-Si-C），這種類(lèi)型的鍵合反應目前被廣泛應用。例如，使用十八烷基三氯硅烷與全孔硅膠M-Porasil-C18 反應生成烷基化學(xué)鍵合相，商標名為 M-Bondapak-C18。

碳含量指的是填料中的碳含量。傳統的測量方法是通過(guò)將填料加熱至碳氫鍵斷裂，然后根據損失的重量或生成的二氧化碳來(lái)計算碳含量。增加碳含量可以通過(guò)增加碳鍵的長(cháng)度或提高鍵合密度來(lái)實(shí)現。隨著(zhù)碳含量的增加，柱子的保留值也將增加。鍵合相的色譜表現與鍵合密度相關(guān)，同時(shí)也與硅膠密度和填料表面積相關(guān)。填料的密度越大，填充柱子所需硅膠的量就越多，柱子的碳含量也會(huì )較高。如果使用兩種不同密度但碳含量相同的填料填充柱子，它們的保留行為將明顯不同。因此，僅僅依靠碳含量來(lái)預測色譜表現是不足夠的。

(5) C18硅烷化試劑是一種大于2納米的大分子，因此與已經(jīng)連接在相鄰硅醇基上的C18硅烷化試劑會(huì )發(fā)生嚴重的立體位阻。這導致硅膠表面有大量殘留的未反應硅醇基，這些極性硅醇基在一些色譜條件下會(huì )與堿性化合物發(fā)生相互作用，導致峰形拖尾，影響定量分析結果。通過(guò)烷基化處理可以在一定程度上解決這些問(wèn)題。烷基化處理是一種在固定相上進(jìn)行的獨立反應，旨在減少硅膠表面的硅醇基。烷基化處理使用小分子試劑（如*硅烷），其空間位阻遠低于C18基團。大多數固定相只有30%的鍵合位置可覆蓋。據報道，通過(guò)有些高活性的化學(xué)試劑和特殊的反應條件，可使覆蓋率提高至50%。深入了解硅膠固定相的物理特性將有助于在高效液相色譜中選擇適合的色譜柱進(jìn)行反應。盡管表面上C18柱的化學(xué)官能團可能相同，但實(shí)際上不同品牌的C18柱性能可能存在很大差異，導致不同的分離結果。

2、C18柱規格對色譜柱的影響

填料柱的選擇對于色譜分離的可能性至關(guān)重要，而柱規格的選取直接影響了分析速度、分離能力、檢測靈敏度以及每次分析所需的溶劑量等。柱規格主要包括兩個(gè)方面：柱內徑和柱長(cháng)度。柱內徑一般在分析型柱中為2～6 mm，制備型柱為20 mm，最大可達80 mm；而柱長(cháng)度分析型柱一般在5～30 cm，制備型柱為15～50 cm。一般來(lái)說(shuō)，柱內徑不會(huì )影響分離效果和分析時(shí)間之間的關(guān)系。

如今，柱技術(shù)已發(fā)展到不同內徑的柱子可以具備相同的性能。不同內徑的柱具有各自特點(diǎn)，在相同的分析時(shí)間和分離效果下，內徑較大的柱消耗的溶劑更多。另一方面，內徑較小的柱需要的樣品量也更少。因此，在樣品有限的情況下，可選擇內徑較小的柱。增加柱長(cháng)度雖然有助于改善分離效果，但也會(huì )增加阻力，需要增加入口壓力。柱壓同時(shí)影響著(zhù)分離效果提升和分析速度減少，是一個(gè)重要的障礙。分離效果、分析速度和柱壓之間相互制約，可以在兩者之間做出選擇，第三個(gè)因素也就隨之確定。長(cháng)柱具有更好的分離效果，短柱則可以實(shí)現更快的分離速度，我們可以根據樣品情況來(lái)選擇合適的色譜柱。