液相色譜柱的選擇方法及使用過(guò)程中可能遇到的問(wèn)題

選擇液相色譜柱的方法和條件

1、填料基質(zhì)

a.硅膠基質(zhì)具有純度高、成本低、強度大、易于進(jìn)行化學(xué)修飾等特點(diǎn)，但其pH值適用范圍有一定限制。一般硅膠基質(zhì)填料在pH2-8之間能保持穩定，而經(jīng)過(guò)特殊修改的硅膠鍵合相則可在pH1.5-10范圍內保持穩定。

b.高分子基質(zhì)：適用范圍廣泛的pH值，具有良好的溫度穩定性（可高達80攝氏度以上），機械強度較低。

2、顆粒外形

絕大多數現代HPLC填料都采用球形顆粒，不過(guò)有時(shí)也會(huì )選擇不規則顆粒。球形顆粒能夠降低柱壓，提高柱效和穩定性，并延長(cháng)柱壽命，尤其在使用高粘度流動(dòng)相時(shí)；而不規則顆粒則具有較大的比表面積，價(jià)格相對較低。

3、顆粒粒徑

顆粒尺寸越小，柱效越高，分離度也更好，但會(huì )導致柱壓力升高。為解決復雜樣品問(wèn)題，可選擇粒徑在1.5-3μm之間的填料，在UPLC中可以使用1.5μm的填料；而粒徑為10μm或更大的填料則適用于半制備或制備柱。

4、含碳量

碳含量是指硅膠表面的鍵合相所占比例，與比表面積、鍵合覆蓋度等因素有關(guān)。高碳含量可提高柱容量、分辨率和分析時(shí)間，適用于需要高度分離的復雜樣品；低碳含量則可縮短分析時(shí)間、展現不同選擇性，適用于快速分析簡(jiǎn)單樣品或需要高水活性相條件的樣品。通常C18的碳含量在7-19%之間。

5、孔徑和表面積比

高效液相色譜（HPLC）的吸附介質(zhì)是由多孔顆粒構成的，大部分反應都發(fā)生在這些孔的表面上。因此，分子必須進(jìn)入孔道才能被吸附和分離。

孔徑和比表面積是兩個(gè)互相關(guān)聯(lián)的概念。如果孔徑較小，則比表面積會(huì )更大，反之亦然。若比表面積較大，會(huì )增加樣品與組分之間的反應，提高保留、上樣量和復雜組分的分離度；而比表面積較小的情況下，平衡時(shí)間更快，適合進(jìn)行梯度分析。

6、孔容和機械強度

孔容，又被稱(chēng)作“孔隙容積”，是指單位顆粒所具有的空隙容積大小。它能有效地展現填料的機械強度。填料的孔隙容積越大，相對機械強度較弱的情況就會(huì )略微增加?？紫度莘e小于1.5mL/g的填料主要用于HPLC分離，而孔容大于1.5mL/g的填料則適用于尺寸排阻色譜和低壓色譜。

7、封端封端

封端可以減少極性堿性化合物的拖尾峰，因為它們與裸露的硅烷基相互作用。沒(méi)有封端鍵合相與封端鍵合相會(huì )對選擇性產(chǎn)生不同的影響，尤其對于極性樣品更為明顯。

液相色譜柱在使用過(guò)程中常出現的問(wèn)題及解決方法

色譜柱使用過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題之一是柱壓增高。柱壓在長(cháng)時(shí)間使用后逐漸上升屬于正?，F象。然而，若柱壓在使用過(guò)程中突然升高（排除系統管路堵塞和壓力傳感器故障），可能存在以下幾個(gè)原因：

1、柱頭的過(guò)濾篩板被堵塞或污染；

2、填料受到樣品污染。

3、在色譜柱內的緩沖液中，如果鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑，就會(huì )發(fā)生結晶析出。

4、流動(dòng)相的 pH 過(guò)大或過(guò)小會(huì )破壞或溶解固定相的結構。

以下是解決方案：

1、如果確定染色層析柱的過(guò)濾篩板被污染，可以嘗試反向使用甲醇將其沖洗至正常壓力，或者將柱頭卸下放入10%稀硝酸中超聲清洗10分鐘，然后再用純水超聲10分鐘，最后重新安裝到染色層析柱中。

2、如果發(fā)現色譜柱填料受到污染，應拆下柱頭螺絲，取出填料前段的污染部分，然后重新填入相同的填料，修復后再安裝回柱頭螺絲。

3、若確認結晶為鹽類(lèi)，請使用10%甲醇/水溶液沖洗色譜柱，使柱內所有鹽類(lèi)溶解，然后轉換為高濃度甲醇。

4、如果 pH 值使用不當，恢復會(huì )變得非常困難。