HPLC的檢測和定量方法

圖 1. 濃度與響應的關(guān)系示意圖

其中，A 是峰面積，b 是分析物校準曲線(xiàn)的斜率，有時(shí)也稱(chēng)為靈敏度。不同化合物的校準曲線(xiàn)斜率 b 值可能不同。因此，通常需要為每種必須定量的分析物生成校準曲線(xiàn)。

為了生成校準曲線(xiàn)，可以使用分析物的純化合物作為校準標準品（以下簡(jiǎn)稱(chēng)校準品），制成不同濃度的溶液。校準品與樣品無(wú)關(guān)，在這種情況下，校準品可視為外部校準標準品（外部校準標準品與樣品在不同的批次中進(jìn)行分析，而內部校準標準品與樣品一起添加和分析）。

在許多實(shí)際應用中，最好是在不含分析物的空白樣品中加入不同含量的校準化合物來(lái)進(jìn)行校準（即含基質(zhì)的標準品）。這種方法可以使含有校準標準的樣品的分析盡可能接近真實(shí)樣品的分析，并可以在分析中減去基質(zhì)的整體影響。對于結構相似的化合物，有時(shí)只使用其中一種化合物的校準曲線(xiàn)，并根據相同的校準品對不同的化合物進(jìn)行定量。但不建議使用這種方法，只有在無(wú)法獲得所有化合物的校準標準品時(shí)才可使用。

有些線(xiàn)性定標不通過(guò)原點(diǎn)，因此必須使用以下形式的關(guān)系來(lái)計算峰面積：

大多數 HPLC 檢測器的峰面積與樣品濃度呈線(xiàn)性關(guān)系。但有時(shí)也會(huì )遇到非線(xiàn)性關(guān)系。非線(xiàn)性可能是由于檢測器過(guò)載造成的，而檢測器本來(lái)應該具有線(xiàn)性響應。此外，極低濃度的分析物也可能導致非線(xiàn)性響應。因此，必須對整個(gè)濃度范圍進(jìn)行線(xiàn)性驗證，尤其要注意極低濃度和極高濃度。熒光檢測的線(xiàn)性范圍僅對低濃度有效。熒光和化學(xué)發(fā)光檢測器有時(shí)需要使用非線(xiàn)性校準曲線(xiàn)。這樣仍然可以直接根據非線(xiàn)性校準曲線(xiàn)或使用相應的關(guān)系式計算濃度。不過(guò)，在一般情況下，線(xiàn)性校準曲線(xiàn)更為可取。

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在許多定量技術(shù)中，每次色譜分析都會(huì )引入內標物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)內標）。內標是實(shí)際樣品中不存在的化合物，在分析過(guò)程中，在選定的時(shí)間點(diǎn)加入一定量的內標，用于驗證重現性、計算樣品損失等。內標的選擇必須使其在分析過(guò)程中的表現與分析物盡可能接近，不干擾分析物的測定，并提供一個(gè)便于積分的色譜峰等。

除了在樣品中加入內標（如通過(guò)樣品制備過(guò)程）外，有時(shí)在處理過(guò)的樣品中加入色譜標準品也很有用。這種標準品是一種內標，僅用于驗證色譜過(guò)程是否正常；它存在于色譜儀的處理過(guò)的樣品中。