色譜分析原理，看完這篇秒懂！

欄目：行業(yè)資訊發(fā)布時(shí)間：2023-03-24

色譜法（chromatography）又稱(chēng)“色譜分析”、“色譜分析法”、“層析法”，是一種分離和分析方法，在分析化學(xué)、有機化學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域有著(zhù)非常廣泛的應用。

色譜法的起源

色譜法的創(chuàng )始人是俄國的植物學(xué)家茨維特（ M.Tswett）。1906年，俄國植物學(xué)家茨維特發(fā)表了他的實(shí)驗結果：為了分離植物色素，他將含有植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸鈣顆粒表面的吸附力不同，隨著(zhù)淋洗的進(jìn)行，不同色素向下移動(dòng)的速度不同，從而形成一圈圈不同顏色的色帶，使各色素成分得到了分離。他將這種分離方法命名為色譜法(chromatography)。

植物葉色素的分離實(shí)驗示意圖

隨著(zhù)分離手段的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的無(wú)色物質(zhì)成為被分離的對象，色譜也漸漸失去了“色”的含義，但這個(gè)名稱(chēng)卻沿用至今。

色譜法分類(lèi)

色譜法的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流動(dòng)相之間分配平衡的過(guò)程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分配會(huì )不同，這使其隨流動(dòng)相運動(dòng)速度各不相同，隨著(zhù)流動(dòng)相的運動(dòng)，混合物中的不同組分在固定相上相互分離。根據不同的機制，可以分多種類(lèi)別。

1、按兩相物理狀態(tài)分類(lèi)

流動(dòng)相：氣相色譜、液相色譜、超臨界流體色譜

固定相：氣－固、氣－液；液－固、液－液

2、按固定相的形式分類(lèi)

柱色譜：填充柱色譜、毛細管柱色譜、微填充柱色譜、制備色譜

平面色譜：紙色譜、薄層色譜、高分子膜色譜

3、按分離機制分類(lèi)

吸附色譜：根據不同組分在吸附劑上的吸附和解吸能力的大小而分離

分配色譜：根據不同組分在固定液中溶解度的大小而分離

分子排阻色譜：依據分子體積大小不同進(jìn)行分離ln離子交換色譜：不同組分對離子交換樹(shù)脂的親和力不同而分離

親和色譜：利用生物大分子之間的存在的專(zhuān)一的特殊親和力進(jìn)行分離

毛細管電泳：依據各組分淌度和（或）分配行為的差異進(jìn)行分離

手性色譜：用于手性藥物的分離分析，可分為三類(lèi)：手性衍生化試劑法；手性流動(dòng)相添加劑法；手性固定相拆分法

色譜法的基本術(shù)語(yǔ)

檢測色譜分離后組分的響應信號對時(shí)間作圖得到的曲線(xiàn)稱(chēng)為色譜圖。

色譜流出曲線(xiàn)

基線(xiàn)：在一定色譜條件下，僅有流動(dòng)相通過(guò)檢測器系統時(shí)所產(chǎn)生的信號的曲線(xiàn)，稱(chēng)為基線(xiàn)，如圖中ot線(xiàn)。實(shí)驗條件穩定時(shí)，基線(xiàn)是一條平行于橫軸的線(xiàn)；基線(xiàn)反映儀器（主要是檢測器）的噪聲隨時(shí)間的變化。

峰高：色譜峰頂點(diǎn)與基線(xiàn)之間的垂直距離，以h表示，如圖AB’線(xiàn)。

區域寬度：色譜峰的區域寬度直接與分離效率有關(guān)。描述色譜峰寬的方法有三種：標準偏差σ、峰寬W、半峰寬W1/2。

標準偏差（σ）：σ為正態(tài)分布曲線(xiàn)上兩拐點(diǎn)間距離之半，σ值的大小表示組分離開(kāi)色譜柱的分散程度。σ值越大，流出的組分越分散，分離效果變差；反之，流出組分集中，分離效果好。

峰寬W：通過(guò)色譜峰兩側的拐點(diǎn)作切線(xiàn)，在基線(xiàn)上的截距稱(chēng)為峰寬，或稱(chēng)基線(xiàn)寬度，也可用W表示，如圖IJ 的距離。根據正態(tài)分布的原理，可證得峰寬和標準差的關(guān)系是W=4σ。

半峰寬W1/2：峰高一半處的峰寬稱(chēng)為半峰寬，如圖 GH 的距離。W1/2=2.355σ，W=1.699W1/2。

W1/2、W都是由σ派生而來(lái)的，除用它們衡量柱效外，還用于計算峰面積。半峰寬測量較方便，最為常用。

小結

由色譜峰流出曲線(xiàn)可以實(shí)現以下目的：

a、依據色譜峰的保留值進(jìn)行定性分析

b、依據色譜峰的面積或峰值進(jìn)行定量分析

c、依據色譜峰的保留值及峰寬評價(jià)色譜柱的分離效能

色譜法涉及到的計算公式

1、保留值

保留值是用來(lái)描述樣品組分在色譜柱中保留程度的參數，并作為色譜定性的指標。其表示方法有：

2、相對保留值

相對保留值又稱(chēng)分離因子、分配系數比或相對容量因子，即在一定色譜條件下，被測組分的調整保留時(shí)間（體積）與標準物的調整保留時(shí)間（體積）之比。

采用相對保留值是為了消除某些操作條件，如流速和固定液流失等，對保留值的影響。相對保留值中標準物可以是被測樣品中的某一組分，也可以是人為加入的某一化合物。

3、保留指數

保留指數為待測物質(zhì)i在某固定液X上的保留指數，選取兩個(gè)正構烷烴作為基準物質(zhì)，其中一個(gè)的碳數為N，另一個(gè)為N+n，它們的調整保留時(shí)間分別為t’R(N)和 t’R(N+n)，使待測物質(zhì)i的調整保留時(shí)間t’R(i)恰好于兩者之間，即t’R(N)

保留指數的計算式為：

4、容量因子（k）

在平衡狀態(tài)下，組分在固定相(s)與流動(dòng)相(m)中的質(zhì)量之比，稱(chēng)為容量因子。公式如下：

5、分配系數（K）

在平衡狀態(tài)下，組分在固定相(s)與流動(dòng)相(m)中的濃度之比，稱(chēng)為分配系數。公式如下：

K與k的關(guān)系：

小結

保留值與容量因子及分配系數的關(guān)系：

色譜分離是基于固定相對試樣中各組分的吸附或溶解能力強弱的不同，而這種吸附或溶解能力的強弱可定量地用分配系數K（或容量因子k）值的大小來(lái)表示。

吸附或溶解能力強的組分分配系數（或容量因子）大，保留時(shí)間長(cháng)；反之，吸附或溶解能力弱的組分分配系數小，保留時(shí)間短。

色譜法的基本理論

1、塔板理論

（1）提出——熱力學(xué)理論

始于馬?。∕artin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。

分餾塔：在塔板上多次氣液平衡，按沸點(diǎn)不同而分離。

色譜柱：組分在兩相間的多次分配平衡，按分配系數不同而分離。

（2）假設

（1）色譜柱內存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內可以很快達到分配平衡。

（2）流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱，不是連續的而是脈動(dòng)式的，即每次通過(guò)為一個(gè)塔板體積。

（3）樣品加在每個(gè)塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略。

（4）在所有塔板上分配系數相等，與組分的量無(wú)關(guān)。即分配系數在各塔坂上是常數。

（3）原理

塔板理論示意圖

若有單位質(zhì)量，即m=1（例1mg或1μg）的某組分加到第0號塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。

當一個(gè)板體積（lΔV）的載氣以脈動(dòng)形式進(jìn)入0號板時(shí)，就將氣相中含有nm部分組分的載氣頂到1號板上，此時(shí)0號板液相中ns部分組分及1號板氣相中的nm部分組分，將各自在兩相間重新分配。故0號板上所含組分總量為0.5，其中氣液兩相各為0.25而1號板上所含總量同樣為0.5．氣液相亦各為0.25。

以后每當一個(gè)新的板體積載氣以脈動(dòng)式進(jìn)入色譜柱時(shí)，上述過(guò)程就重復一次(見(jiàn)下表)。

（4）色譜流出曲線(xiàn)方程

（5）色譜柱效參數

在tR一定時(shí)，W或W1/2越小(即峰越窄)，理論板數n越大，理論板高越小，柱的分離效率越高。有效理論塔板neff也同此理。因此，理論塔板數是評價(jià)柱效能的指標。

（6）特點(diǎn)及不足

2、速率理論

1956年荷蘭學(xué)者VanDeemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素結合起來(lái)，提出了色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)理論——速率理論，導出了Van Deemter方程。它把色譜過(guò)程看作一個(gè)動(dòng)態(tài)非平衡過(guò)程，研究過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)因素對峰展寬（即柱效）的影響。

后來(lái)Giddings和Snyder等人在VanDeemter方程（后稱(chēng)氣相色譜速率方程）的基礎上，根據液體與氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程（即Giddings方程）。

（1）Van Deemter方程

（2） Giddings方程

定量與定性分析

（一）定性分析

色譜定性分析就是要確定各色譜峰所代表的化合物。由于各種物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定的保留值，因此保留值可作為一種定性指標。目前各種色譜定性方法都是基于保留值的。

但是不同物質(zhì)在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保留值，即保留值并非專(zhuān)屬的。因此僅根據保留值對一個(gè)完全未知的樣品定性是困難的。如果在了解樣品的來(lái)源、性質(zhì)、分析目的的基礎上，對樣品組成作初步的判斷，再結合下列的方法則可確定色譜峰所代表的化合物。

1、利用純物質(zhì)對照定性

在一定的色譜條件下，一個(gè)未知物只有一個(gè)確定的保留時(shí)間。因此將已知純物質(zhì)在相同的色譜條件下的保留時(shí)間與未知物的保留時(shí)間進(jìn)行比較，就可以定性鑒定未知物。若二者相同，則未知物可能是已知的純物質(zhì)；不同，則未知物就不是該純物質(zhì)。

純物質(zhì)對照法定性只適用于組分性質(zhì)已有所了解，組成比較簡(jiǎn)單，且有純物質(zhì)的未知物。

2、相對保留值法