反相色譜柱的活化步驟和優(yōu)化條件

反相色譜柱具有硅膠和聚苯乙烯色譜柱的優(yōu)點(diǎn)，摒棄了這兩種色譜柱的缺點(diǎn)。以乙烯醇共聚物為基質(zhì)的色譜柱，即使碳含量高，也能保持表面濕潤。多孔結構對小分子化合物有足夠的平均孔徑.肽和小分子蛋白可以產(chǎn)生理想的分離效果。在有機溶劑比例較高的流動(dòng)相中，色譜柱具有與硅膠基質(zhì)色譜柱相同的柱效應，但在堿性緩沖溶液為流動(dòng)相的情況下，其分離效率超過(guò)硅膠色譜柱。其中一個(gè)顯著(zhù)的特點(diǎn)是烷基填料的洗滌順序，其保留能力與碳鏈的長(cháng)度成正比。

反相色譜柱的活化步驟:

1.用20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱；

2.如果流動(dòng)相含有緩沖鹽，用與流動(dòng)相中鹽相等比例的超純水和有機相沖洗過(guò)渡。用量為20倍柱體積，然后用含緩沖鹽的流動(dòng)相平衡色譜柱，用量為20倍柱體積或以上；

3.流動(dòng)相不含緩沖鹽的，用流動(dòng)相平衡色譜柱，用量為20倍以上；

4.壓力基線(xiàn)穩定，如不穩定，可延長(cháng)平衡時(shí)間。

優(yōu)化反相色譜柱的條件：

確定色譜柱規格.適當的固定相柱填料.流動(dòng)相溶劑和改性劑后，可以開(kāi)始優(yōu)化方法。方法的優(yōu)化是根據目標來(lái)決定的。如果你想開(kāi)發(fā)一種質(zhì)量控制方法，可能需要更少的可變因素，比如等度分離。如果目標是獲得更高的分離度，節省分析時(shí)間并不是主要問(wèn)題，你可以選擇一個(gè)長(cháng)柱來(lái)獲得更大的分離度。如果分離速度非常重要，則應使用短柱和高流速。對于含有許多保留不同目標化合物的復雜樣品，等度分離可能無(wú)法解決問(wèn)題，應開(kāi)發(fā)和優(yōu)化梯度方法。

水相溶劑和反相色譜中的弱溶劑被稱(chēng)為流動(dòng)相“A”，“B”溶劑是一種具有高相和強相的溶劑。在反相色譜模式下，當B的百分比增加時(shí)，保留率通常會(huì )降低。請注意，在開(kāi)發(fā)樣品的實(shí)際分析方法之前，大多數人都開(kāi)發(fā)了HPLC采用所有方法“反復實(shí)驗”方法，即嘗試各種流動(dòng)相條件，以找出更好的條件。